新生兒腸道微生物演替的文獻筆記
嬰兒共生菌相的成熟過程及其與分娩方式的關聯
Chu et al. (2017). Maturation of the infant microbiome community structure and function across multiple body sites and in relation to mode of delivery. Nature medicine.
人類的共生菌不僅協調內分泌、免疫和代謝機能，也參與這些器官系統的發育，失衡的菌落往往和疾病相關。因此，想要理解宿主怎麼和微生物發展共生關係並保持健康或導致疾病，就需要更深入理解微生物在宿主身上的建立過程。
人體微生物計畫第一期的結果指出，成年人的身體各處有不同的微生物相。根據 Costello 在 2013 年於早產兒的研究指出，這種微生物相差異一直要到出生後三個星期才逐漸變得明顯。這項研究雖然觀察到微生物在不同身體部位的演替趨勢，但樣本過少，也只限於早產族群。此外，還忽略了影響微生物建立的外在因素。
新生兒接觸的環境決定了個體微生物的來源，而人體的免疫系統或飲食等因素則決定有哪些微生物可以順利拓殖。許多研究指出分娩方式和新生兒共生菌的類型相關，不過這些研究同樣面臨樣本數過少的問題。
另一點值得議論的是，自然產和剖腹產可能不是良好的劃分方式。原則上，自然產的新生兒會首先接觸到陰道菌群，而剖腹產的新生兒會首先接觸到皮膚菌群。但是採取剖腹產的原因可能是胎位不正、產前出血或自然產失敗，因應不同的狀況會有不同的醫療處置，這些處置也成了潛在的干擾因素。
所以為了了解健康人群的微生物建立過程，這項研究納入了更多的樣本，觀察與比較新生兒身上不同部位的微生物相隨時間的變化，並且考量前述的干擾因素，重新評估分娩方式對微生物相建立的影響。
以分子技術監測人類新生兒的細菌群集演替
Favier et al. (2002) Molecular Monitoring of Succession of Bacterial Communities in Human Neonates. Applied and Environmental Microbiology.
嬰兒無菌的腸道在出生後逐漸被細菌拓殖，了解腸道微生物及影響其拓殖的因素可能提供調控微生物的機會。腸道微生物的組成深受飲食影響。當今對於嬰兒腸道微生物相的理解幾乎全數得自於基於培養方法的研究，然而腸道微生物多由難以培養的厭氧菌組成，費時的厭氧培養也限制了研究的規模。
近期，基於 16S rRNA 等分子的微生物學技術逐漸用於研究複雜的微生物生態學，但是僅有少量的研究採分子技術研究嬰兒腸道微生物。例如 Fluorescent in situ hybridization (FISH) 即用於定量分析源於不同飲食型態的嬰兒腸道微生物樣本，然而這類技術的研究範圍受限於引子的種類。
PCR 及 denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) 更常用於微生物生態學研究。PCR 和 DGGE 配合定序技術能夠有效地鑑識分類群，而相關技術也已被用於研究與早產兒之壞死性腸炎有關的細菌。因此，Favier et al. 使用 PCR-DGGE 探討兩名嬰兒的排遺樣本，以了解腸道細菌群集在產後十個月內的演替。
此研究探討與嬰兒飲食相關的腸道微生物相差異，但標題與文中強調的是以分子技術研究相似主題的開創性。因此，Favier et al. 首先提出困境：腸道微生物研究受限於可培養的細菌種類。
這問題顯然不是 Favier et al. 發現的，但為什麼前人沒辦法解決，此研究卻能夠克服克服？為了解釋這點，Favier et al. 提到了分子技術的發展使難養菌的研究便得可行，再比較不同分子技術的優劣，以支持研究的合理性。
哺乳與餵配方奶之嬰兒的雙歧桿菌及乳桿菌多樣性區別
Satokari et al. (2002) Diversity of Bifidobacterium and Lactobacillus spp. in Breast-Fed and Formula-Fed Infants as Assessed by 16S rDNA Sequence Differences. Microbial Ecology in Health and Disease.
人體腸道微生物的拓殖使於出生後與生母及環境的接觸，隨後歷經數階段的演替逐漸形成複雜而穩定的成人微生物相。分娩方式、用藥、飲食等因素皆與腸道微生物的拓殖與演替有關。
早期的培養學研究發現，相較於餵食配方奶的嬰兒，Bidobacteria 是採樣自哺乳嬰兒的排遺樣本中的優勢微生物群。然而，相異研究的結果往往彼此衝突，因此與哺乳相關的微生物相差異仍無共識。
Fluorescent in situ hybridisation、dot blot hybridisation, and 和其他以 PCR 為基礎的分子技術能更精確地辨識微生物組成差異。因此 Satokari et al. 使用 PCR 及 temperature or denaturing gradient gel electrophoresis 等技術研究腸道微生物的 16S rDNA ，比較哺乳和餵配方奶的嬰兒在離乳前後，Bifidobacterium 和 Lactobacillus 等與哺乳相關的菌群組成差異。
Satokari et al. 試圖以基於 16S rDNA 的分子技術研究嬰兒腸道微生物，解釋以培養為基礎的研究得出的衝突結果。只是作者沒有在導言中說清楚為什麼採用其他技術就能克服不同研究的矛盾，也沒有講解為什麼目前沒有相似研究的原因。畢竟各研究結果有異的原因可能是因為研究族群、材料、方法的差異，我覺得如果作者能解釋採用新技術優於統合分析等方法的理由，那這篇論文的問題脈絡便更清楚了。
利用 PCA 和 T-RFLP 比較不同年齡之嬰兒排遺微生物相
Wang et al. (2004) T-RFLP combined with principal component analysis and 16S rRNA gene sequencing: an effective strategy for comparison of fecal microbiota in infants of different ages. Journal of Microbiological Methods.
人體的腸道微生物可能參與宿主的營養代謝、病源入侵和免疫反應的過程，進而影響宿主的健康狀況。研究健康嬰兒腸道菌群的結構與動態或能幫助我們了解過敏性疾病的成因，奠立相關疾病之預防醫學的基礎。
目前嬰兒腸道微生物的生態學知識多得自於基於培養學的研究。然而，培養技術受限於難養菌的存在及定量菌群規模的困難。雖然可透過擴增和複製 16S rDNA 來補足培養學的限制，但這類技術勞力費時，不易應用於大規模樣本的對照研究。
Terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) 是環境微生物生態學常用的技術，雖然其具有高效和便捷等優點，但分析 T-RFLP 得出的大量數據相當困難。為克服詮釋數據的困難，Wang et al. 引進主成分分析來探索，腸道正處發育階段的嬰兒之排遺微生物群變化。
此文的主題、背景、問題、既有研究、難點和解決方案都交代了：以腸道微生物與疾病的關聯起頭，強調研究嬰兒腸道微生物發育的重要性。接著指出培養技術和其他替代方案之缺陷，最後提出結合 T-RFLP 和主成分分析或能克服難養菌與解釋數據的困境。
健康且哺乳嬰兒的腸道微生物與免疫標記物在副食哺餵期間之轉變
Amarri et al. (2006) Changes of Gut Microbiota and Immune Markers During the Complementary Feeding Period in Healthy Breast-fed Infants. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition.
嬰兒無菌的腸道在出生後逐漸被細菌拓殖。雖然各研究的結果有些差異，但親餵與瓶餵的嬰兒之腸道微生物發育模式不同，哺乳嬰兒的腸道往往有較多的 bifidobacteria 和較少的 Enterobacteriaceae。在副食添加期間，哺乳的嬰兒腸道中的 enterobacteria 和 enterococci 數量漸增，隨後 Bacteroides、clostridia 和厭氧性 streptococci 也逐漸拓殖。
在離乳之後，親餵與瓶餵的嬰兒腸道的厭氧微生物逐漸演變為似於成年人腸道菌群的組成，同時兼性厭氧菌的數量也逐漸下降。目前，探討嬰兒腸道微生物演替在添加副食品和離乳期間的研究有限，少數以此為題的研究之定群規模和追蹤時數也不足。
鑒於嬰兒腸道微生物對幼兒往後健康狀況的重要性，此研究的目的是探討數種腸道微生物，以及免疫標記和腸漏指標物在嬰兒添加副食期間的轉變。
此文的寫法是依序解釋嬰兒腸道微生物的演替、哺乳相關的微生物相差異、腸道微生物與免疫的關聯等主題的研究成果，然後說明相關主題沒人做，所以自己跳下來做。我覺得這種寫法比較不有趣，因為沒有講解為什麼別人不做，也沒有講解解決問題的推理過程，讓人感覺問題之所以被解決，是增加資源而不是有什麼新的觀點。
離乳期間嬰兒排遺微生物相的縱向研究
Magne et al. (2006) A longitudinal study of infant faecal microbiota during weaning. Federation of European Microbiological Societies.
嬰兒腸道微生物相受多種環境因素影響，其中以飲食型態最為重要。相較於餵食配方乳，餵食母乳可能助長嬰兒腸道中的 bifidobacteria 並抑制 Bacteroides、Clostridium 和 Enterobacteria 等厭氧菌的增殖。
由於腸道微生物可作為防範病原的屏障，哺乳可能保護嬰兒免於特定疾病。以痢疾和呼吸道疾病為例，相較於提早餵食副食品的嬰兒，在發展中國家中這兩項疾病在哺乳的嬰兒之盛行率較低。
儘管添加副食可能影響嬰兒排遺樣本的微生物相組成，相關的研究仍然有限。雖然曾有研究以培養方法發現 Enterococci 和 Bacteroides 的數量在已添加副食品的嬰兒（六個月大）中較高，但此研究並沒有控制各嬰兒的飲食型態，因此難以評估飲食對腸道微生物的影響。此外，由於飲食型態的轉變是漸進過程，所以也增添評估副食影響的難度。
鑒於這些困難， Magne et al. 統一研究對象的飲食內容（餵食相同的配方乳），並將嬰兒的飲食階段分為哺乳期、哺乳配合配方乳、僅餵食配方乳三個階段，使用 PCR-temporal temperature gradient gel electrophoresis 評估排遺樣本內的微生物在離乳期間的變化，以了解飲食轉變對於腸道微生物的衝擊。
- 主題：嬰兒腸道微生物相與飲食行為轉變的關係
- 觀察：在開發中國家裏，哺乳嬰兒的痢疾與呼吸道疾病盛行率低於提早添加副食者
- 假說：飲食影響腸道微生物組成、部分微生物能防範病原入侵、哺乳能助長益菌發展）
- 預測：添加副食對嬰兒腸道微生物相可能有別於哺乳的影響）
- 缺口：既有研究沒有控制飲食型態、飲食轉變是漸進過程
- 解方：控制飲食內容、分期觀察
- 目的：透過前述解方研究腸道微生物相在飲食轉換期間的變化
影響嬰兒早期腸道微生物組成的因素
Penders et al. (2006) Factors influencing the composition of the intestinal microbiota in early infancy. Pediatrics.
由於腸道微生物攸關人體健康，了解腸道微生物的組成與建立相當重要。雖然已有文獻報導分娩方式、飲食和環境等因素與腸道微生物的關聯，但這些研究多半僅聚焦特定因素，且涵蓋的樣本數有限，以至於難以符合隨機分派的研究標準。
因此，Penders et al. 在荷蘭施行了一項前瞻性研究，分析千餘名足月嬰兒的排遺樣本，以透過大規模的調查，來評估影響嬰兒早期腸道微生物組成的多種因素。
可能因為這是項探索性研究，所以論文中沒有把問題描述得很清楚。
- 主題：影響嬰兒腸道微生物相的因素
- 疑難：樣本數不足以符合隨機分派的標準，以至於無法排除干擾因素的影響
- 策略：使用更多的樣本
利用即時 PCR 和北方墨點法定量嬰兒排遺內的腸道細菌
Hopkins et al. (2005) Characterisation of intestinal bacteria in infant stools using real-time PCR and northern hybridisation analyses. FEMS Microbiology Ecology.
(1) 腸道細菌的拓殖受飲食、環境、抗生素施用及年齡影響。(2) 由於哺乳及益生菌在預防腸道疾病的功效，許多研究探討了哺乳與腸道微生物的關聯。(3) 即時 PCR 可以克服難養菌的限制，也能研究北方墨點法無法偵測到的少量細菌。(4) 因此 Hopkins et al. 分別使用即時 PCR 和北方墨點法，定量常見的腸道微生物並了解其與飲食型態的關聯，聚焦的菌群如下：
Bacteroides and bifidobacteria 在碳水化合物的代謝中扮演重要角色，其中常用作益生菌的 bifidobacteria 是嬰兒腸道的優勢菌群。
Enterococcus faecalis （一類兼性厭氧菌）是許多感染性腸炎的病原，且被認為與逐漸盛行的抗藥性有關。
Dissimilatory sulfate-reducing bacteria 可能與發炎性腸道疾病有關。
句子 (1) 說明研究主題，接著利用句子 (2) 的推理點出研究問題：「腸道微生物與哺乳行為的關聯是什麼？」（推理方式：哺乳與預防疾病有關 → 益生菌與預防疾病有關 → 哺乳可能透過改變腸道微生物達到預防疾病的效果 → 研究哺乳與微生物的關聯）。
Hopkins et al. 沒有明確指出研究難題（或研究立基）是什麼，但從句子 (3) 看來，應該是想表達即時 PCR 和北方墨點法可以相輔相成，克服培養學的部分限制。最後句子 (4) 解釋了選擇的研究目標和理由。
由於腸道菌與飲食的關聯是一個很大的題目，所以論文標題有「使用某某技術」的字眼限制研究範圍。不過即使如此，問題還是沒有很明確，這可能是因為早期的腸道微生物研究仍在探索階段的關係。
利用 FISH 描繪餵食配方奶和母乳的嬰兒之排遺樣本微生物相
Bezirtzoglou, Tsiotsias, and Welling (2011) Microbiota profile in feces of breast- and formula-fed newborns by using fluorescence in situ hybridization (FISH). Anaerobe.
(1) 由於微生物涉及宿主的營養代謝、免疫運作與致病機制，正常的微生物相攸關宿主的健康。(2) 為了瞭解微生物與宿主生理及健康的關聯，精確測量微生物的組成相當重要。(3) 既有研究受限於培養方法，僅能探討可培養的菌群，而這些菌群也可能受培養環境的選擇性影響（特異性太差或靈敏度太低）。(4) 這兩項因素導致基於培養方法的研究無法充分比較人體共棲菌群的差異。
(5) 若能更細緻地紀錄排遺樣本的微生物相，將有助於我們了解腸道疾病的病理機致，也能提升治療手段的效率和特異性。(6) 此外，增進腸道微生物變化的知識有助於我們了解健康人與患者的腸道微生物生態。(7) 然而培養方法難以反映腸道微生物在處於不同狀態的宿主的變化。
(8) 近年來，分子技術逐漸用於微生物生態學研究，這些技術使排遺微生物的研究能克服培養方法的限制。(9) Fluorescence in situ hybridization (FISH) 是其中最直接，且能辨識複雜生態系統中單一細胞的技術。(10) 因此 Bezirtzoglou, Tsiotsias, and Welling 使用 FISH 來比較餵食配方奶和母乳的嬰兒之排遺樣本微生物相，以取得培養學方法無法獲得的資訊。
句子 (1) 說明重要性，句子 (2) 提出研究問題。句子 (3)、(4) 說明研究難題和既有研究的限制，句子 (5)、(6)、(7) 解釋若不解決這些難題會有什麼後果。句子 (8) 呈現克服難題的轉機，句子 (9) 說明克服難題的策略，句子 (10) 表明研究目的。
簡而言之，此文的核心概念是：「測量微生物的方法很重要，過去的方法不好，所以我採用新方法來研究微生物。」不過雖然說明了重要性和必要性，但沒有解釋為什麼 FISH 比其他技術好。不過這也許是當代的常識，所以才沒有特別提點。
人類嬰兒排遺樣本內的腸道微生相在首次引入副食後的決定因素
Fallani et al. (2011) Determinants of the human infant intestinal microbiota after the introduction of first complementary foods in infant samples from five European centres. Microbiology.
(1) 早期發生在嬰兒腸道微生物的事件可能對慢性疾病的發展有長遠影響。(2) Fallani et al. 先前曾指出腸道微生物初期的拓殖深受嬰兒飲食行為、分娩方式、國籍和抗生素施用影響。(3) 在此研究中，Fallani et al. 則要檢視腸道微生物在離乳期間的變化。
(4) 離乳期間，嬰兒的腸道出現新的不可消化碳水化合物，消化系統和免疫系統也逐漸成熟。這些環境條件的變化可能影響微生物的組成。(5) 然而，目前針對嬰兒腸道微生物在離乳期間之變化的研究有限，而探討離乳前的飲食和各項臨床因素在引入副食後對腸道微生物之影響的研究也闕如。
(6) 因此，Fallani et al. 分析了來自五個歐洲國家的嬰兒在離乳前後採集的排遺樣本內的微生物，探討嬰兒腸道微生物在離乳期間的變化，並評估影響此過程的其它臨床因素。
句子 (1) 說明主題和重要性，句子 (2) 作為鋪陳，以說明研究目的（句子 (3)）。句子 (4) 預測「離乳 → 腸道環境變化 → 微生物組成改變」。句子 (5) 說明研究利基，句子 (6) 具體說明研究目的和內容。
嬰兒排遺微生物相之發展及其與分娩方式、飲食及過敏疾病的關聯
Galazzo et al. (2020) Development of the Microbiota and Associations With Birth Mode, Diet, and Atopic Disorders in a Longitudinal Analysis of Stool Samples, Collected From Infancy Through Early Childhood. Gastroenterology.
(1) 出生後的腸道微生物拓殖攸關免疫系統發育與成熟，許多流行病學研究指出，嬰兒腸道微生物與哮喘及過敏性疾病息息相關。(2) 儘管與過敏或哮喘相關的微生物已被辨識，但何者對疾病有正面影響，又何者有負面影響仍不明確。
(3) 這種現象可能是方法學差異、樣本數不足或沒有控制好混淆因素所致。(4) 此外，雖然橫斷研究設計普遍用於探討微生物相與疾病的關係，但難以排除反向因果關係；而縱向研究設計雖然能克服反向因果的問題，但有限的縱向研究欠缺足夠的追蹤時間，所以仍難以了解腸道微生物相的變化與病程的關係。
(5) 因此，Galazzo et al. 追蹤 440 名嬰兒周歲前的排遺樣本微生物變化 (n = 1453)，藉由提升樣本數來排除臨床上的混淆因子，以研究腸道高度複雜且動態的微生物生態系。
句子 (1) 說明主題和研究重要性，句子 (2) 提出研究問題，句子 (3) 、(4) 解釋研究難題：「橫斷研究難以釐清因果，而縱向研究的樣本數又不夠」，句子 (5) 解釋研究策略（增加樣本數）和研究目的。
(1) 產後 13 、21、31 周，哺乳解釋了最多的腸道微生物組成變異（以 EnvFit 建模，用 r^2 度量解釋率）
(2) 產後 13 、21、31 周，腸道微生物組成因哺乳與否而異 (Permutational multivariate analysis of variance based on unweighted UniFrac)
(3) 相較於哺乳，添加副食僅在產後 31 周與腸道微生物組成相關，而且關聯性也較哺乳低。
(4) Bifidobacteria、staphylococci、streptococci 的相對數量在停止餵食母乳後顯著下降，而 Lachnospiraceae 的細菌之相對數量則上升 (Multivariate Analysis by Linear Models)
(5) 哺乳的時間長短與微生物相年齡負相關 (Multivariate Analysis by Linear Models)
【討論】依據結果 (1)、(2)、(3)，Galazzo et al. 推論唯有在離乳後，隨著母乳寡糖及其降解物質減少，才會加速腸道微生物相成熟的進程（即能代謝複雜碳水化合物的菌屬成為腸道的優勢菌屬）。
原則上，哺乳佔嬰兒飲食的比例會隨年齡增長而下降，相對地，攝取副食品的比例會逐漸上升。我最初以為微生物相的變化可能會反映飲食型態的轉變模式。然而此文及其引用的文獻卻指出，添加副食只有在離乳後才會對腸道微生物相有影響。
這個現象意味著，與哺乳相關的微生物特徵和母乳攝取量無關，亦或是離乳對腸道微生物的影響遠大於母乳攝取量的影響。（不過也可能是推論的基礎有誤，或許這些嬰兒的飲食變化是劇烈而非漸進的）