怎麼準備 bwa 所需的 .alt 檔？
因應 GRCh38 納入 alternate contigs (ALT contigs)，BWA 早在 2014 的更新 便開始支援 alt-aware mapping（詳見 bwa/README-alt.md 以及 GATK 的教學）。
使用 alt-aware mapping 模式需要準備 .alt 檔，它記錄了 ALT contigs 在參考基因體 (primary contigs) 的位置，可以用 ALT contigs 拿 BWA 比對參考基因體生成。因此，*.alt* 實際上是 SAM 格式，而不是使用 bwa index 建立的索引格式。
1 | bwa mem ref.fa alt.fa > ref.fa.alt |
ALT contigs 是同段基因在不同族群的變體，納入它們可以提升參考基因體的族群代表性。人類參考基因體的建置最初僅納用少數個體的定序資料。人類基因體有一些多樣性高的區域（例如 MHC），它們的序列往往迥異於參考基因體，所以比對軟體難以定位來自這些區域的定序產物，降低變異分析的靈敏度。為了減輕參考基因體相關的偏誤，GRCh38 版本基於千人基因體 (1000 Genomes) 等計畫的研究成果，納入了將近 109 Mb 長的 ALT contigs。
然而，ALT contigs 仍保留與參考基因體相似的片段。因此，一條序列可能同時吻合 ALT contigs 或原參考基因體，導致軟體無法區別序列來源，低估了比對的可信度（即 MAPQ, Mapping Qualities）。詳情可參考 illumina 簡介：ALT-Aware mapping。
為此，需要額外資訊來記錄 ALT contigs 和參考基因體的關係，讓比對軟體能妥善處理 GRCh38 這類含有 ALT contigs 的參考基因體。在 bwa，額外資訊儲存在 .alt。
.alt 的格式為 SAM，記錄了每條 ALT contigs 在原本參考基因體的位置。提供 .alt 之後，bwa 會註記能比對到 ALT contigs 的結果。假如序列與 ALT contigs 契合，bwa 便會以 ALT contigs 為代表來計算比對分數，最後透過 .alt 的座標資訊找到輸入序列在參考基因體的正確位置。
建立 .alt 的具體做法如下：假設有參考基因體 ref.fa 和 ALT contigs alt.fa，首先使用 bwa 創建 .alt 檔，再合併 ref.fa 和 alt.fa 為含有 ALT contigs 的 ref_alt.fa。最後再用 bwa index 生成其他序列比對所需的索引檔。
1 | bwa mem ref.fa alt.fa > ref.fa.alt |
剩下步驟可參考 How to Map reads to a reference with alternate contigs like GRCh38 ，簡言之，使用 alt-aware mapping 只是第一步，還需要用 bwa-postalt.js 腳本處理那些有配對到 ALT contigs 的序列（這支腳本擺在 bwa/bwakit 裡面，所以要去 github 下載）。
註 1： .alt 是採用 alt-mapping 的必要檔案，但本文提到的參考資料都沒講清楚它的生成方式，才會有那麼多貼文求助。
註 2：當初這方法提出時，bwa 的作者其實不鼓勵使用含有 ALT contig 的參考基因體，不過現今 WGS/WES 成熟、註解資料庫相容、而且有許多 multi-genome mapper，風向也漸漸改變了。